亲权鉴定技术规范_陕西佰美司法鉴定所

亲权鉴定技术规范

1范围
    本标准规定了我国法医DNA 实验室进行亲权鉴定所必须遵循的技术要求。本标准适用于从事亲权鉴定的DNA实验室，不适用于大通量数据库的比对。

2 规范性引用文件
    下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本部分的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可适用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
CNAS-CL01:2006 检测和校准实验室认可准则 GA/T382－2002 法庭科学DNA实验室规范 GA/T383－2002 法庭科学DNA实验室检验规范

3 术语和定下列术语和定义适用于本标准。
3.1 亲权鉴定 Parentage Testing
亲权鉴定是通过对人类遗传标记的检测，根据遗传规律分析，对个体之间血缘关系的鉴定。
3.2 三联体亲子鉴定 Parentage Testing of Trios
被检测男子、孩子生母与孩子的亲子鉴定。
3.3二联体亲子鉴定 ParentageTesting of Duos 被检测男子与孩子的亲子关系鉴定。注：被检测女子与孩子的亲子关系鉴定也属于二联体亲子鉴定，但本标准界定的是被检测男子与孩
子的亲子关系鉴定。
3.4 祖孙亲缘关系鉴定 Kinship Analysisof Grandparents and Grandchildren
祖孙亲缘关系鉴定是通过对人类遗传标记的检测，根据遗传规律分析，对有争议的祖父母与孙子女血缘关系的鉴定。
3.5 遗传标记 GeneticMarker
具有多态性的基因座。用于亲子鉴定的遗传分析系统由一定数量的遗传标记组成，常用的有常染色体短串联重复序列（STR）、Y染色体短串联重复序列（Y-STR）、X染色体短串联重复序列（X-STR）。
3.6 排除概率 Power of Exclusion, PE
对于不是孩子生父的随机男子，遗传分析系统具有的排除能力。它是遗传分析系统效能的评估指标。
3.7 亲权指数 Paternity Index,PI
亲权指数是亲权关系鉴定中判断遗传证据强度的指标。它是两个条件概率的似然比率:
         PI=概率检测到当事人的遗传表型假设被检测男子是孩子的生物学父亲
         PI=概率检测到当事人的遗传表型假设一个随机男子是孩子的生物学父亲 < c)    高速振荡5-10s，沸水煮8min；
d)    高速振荡5-10s，10,000-15,000 r/min离心2-3min；
e)    取上清液用于扩增反应；2-8℃保存或冻存剩余DNA。

4.2.3 从毛发中提取DNA：
a)    用纯水清洗毛发；剪取毛根部分，放入1.5mLEppendorf管中；
b)    加入200µL5%Chelex100（100-200 目）及2µL10mg/mLPK（蛋白酶K），56℃保温6-8hr或过夜；
c)    高速振荡5-10s；沸水煮8min（注意毛发应浸没于Chelex液中）；
d)    高速振荡5-10s；10,000-15,000 r/min 离心2-3min；取上清液用于扩增反应，2-8℃保存或冻存剩余DNA。

4.2.4 从精液中提取DNA：
a)    取精液（不少于3µL）放入1.5mL离心管内，加入200µL5%Chelex 100（100-200 目）；
b)    加入2µL10 mg/mL 蛋白酶K 和7µL1mol/LDTT，轻轻混匀；
c)    56℃保温30-60min，高速振荡5-10s；
d)    10,000-15,000 r/min 离心10-20s；
e)    沸水煮8min；
f)    高速振荡5-10s；
g)    10,000-15,000 r/min 离心3 min；
h)    取上清液用于扩增反应；
i)     2-8℃保存或冻存剩余DNA，再次使用时重复步骤f)-h)。

4.2.5 从精斑样品中提取DNA：
a)    适量精斑检材，剪碎后放到1.5mL离心管中；
b)    加入1mL 纯水，室温保温30min； c) 高速振荡1min，用牙签去除载体； d)      10,000-15,000 r/min 离心2 min；
e)    去上清仅留50µL，用无菌吸头吹打沉淀；
f)    加入5%Chelex100（100-200目）至200 µL，加入2µL10mg/mL蛋白酶K和7µL1mol/LDTT，轻轻混匀；
g)    56℃保温60min；
h)    高速振荡5-10s，10,000-15,000 r/min离心10-20s；
i)     沸水煮8min；
j)     高速振荡5-10s，10,000-15,000 r/min离心3min；
k)    取上清液用于扩增反应；
l)     2-8℃保存或冻存剩余DNA，再次使用时重复步骤i)-k)。检验程序

4.2.6 从人体组织块中提取DNA：
a)    取适量组织块，用纯水冲洗；
b)    剪碎（或研磨成碎块），加入1mLSTE 提取液（100mmol/LNaCl，10mmol/LTris-HCI，1mmol/L EDTA，pH8.0)，混匀后加入20%    SDS75 µL，10mg/mL蛋白酶K 40 µL，于56℃酶解至清；
c)    于1.5mL 离心管中加入200µL10%Chelex100（100-200 目），加入上述酶解后溶液20µL，混匀；
d)    56℃保温30min； e) 剧烈振荡5-10s； f)   沸水煮8min；
g)    剧烈振荡5-10s；10,000-15,000 r/min离心3min；取上清液用于扩增反应；
h)    2-8℃保存或冻存剩余DNA，再次使用时重复步骤g)。

4.2.7 从羊水中提取DNA：
a)    取羊水约1.5 mL，10,000~15,000 r/min 离心5min，弃上清；
b)    在沉淀中加入200µL5%Chelex（100-200目）溶液和20 µL10 mg/mLPK，56℃保温3 hr；
c)    高速振荡5-10s，沸水浴8min；
d)    高速振荡5-10s，10,000~15,000r/min 离心5min，取上清液用于扩增反应；
e)    2-8℃保存剩余DNA，再次使用时重复步骤d)。

4.3DNA 定量分析
按照中华人民共和国公共安全行业标准GA/T382-2002和GA/T383-2002 的要求进行。

4.4PCR 扩增与分型
4.4.1基因座
   选用多态性基因座（如STR、SNP 等类型）进行PCR扩增，其中，常染色体STR基因座宜符合如下要求：（1）经过群体遗传学调查，多态性高，非父排除率在0.7以上。（2）经过500次以上减数分裂的家系调查，基因座的突变率在0.002以下。目前，建议采用商品化试剂盒进行检验，检测系统的累计非父排除率应达到99.99%以上。除常染色体基因座外，建议在需要时增加Y-STR、X-STR的检验。其中，Y-STR系统可选择DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS458、DYS19、DYS385a/b、DYS393、 DYS391、DYS439、DYS635、DYS392、YGATAH4、DYS437、DYS438、DYS448等基因座进行单倍型检验；X-STR系统可选用GATA172D05、HPRTB、DXS6789、DXS6795、DXS6803、DXS6809、DXS7132、 DXS7133、DXS7423、DXS8377、DXS8378、DXS9895、DXS9898、DXS10101、DXS10134、DXS10135、 DXS10074等。
4.4.2扩增试剂
   建议选用商品化试剂盒（带荧光标记的PCR体系）。若选用其它来源的扩增体系，须经验证、认可后方可用于日常检案。每批检验均应用标准样品（已知浓度和基因型的Control DNA）和（或）以前检验过的、已知基因型的样本作为阳性对照，以不含DNA 的样本作为阴性对照。
4.4.3 PCR体系与温度循环参数按试剂盒的操作说明书进行。
4.4.4扩增产物的检测与结果的判读
使用荧光分析仪，对PCR产物进行毛细管电泳分析，使用等位基因阶梯（Ladder）作为参照品来判别样本的基因型，步骤方法按照仪器操作手册。

4.5鉴定意见
   鉴定意见是依据DNA 分型结果对是否存在亲权关系作出的判断。鉴定意见一般分“排除存在亲权关系”和“支持存在亲权关系”两种情形。
4.5.1排除存在亲权关系
经过累计非父排除率大于99.99%的多个基因座的检测，发现有3个以上的基因座不符合遗传规律，可以排除亲权关系的存在。
4.5.2支持存在亲权关系
经过累计非父排除率大于99.99%的多个基因座的检测，发现基因座均符合遗传规律，此时必须计算亲权指数PI（即似然率LR），若CPI≥10000，则支持亲权关系的存在。
4.5.2.1 累积亲权指数计算：
CPI=PI1×PI2×PI3×…×PIn(1、2、3、n代表第1、2、3、n个基因座的PI 值)
4.5.2.2 常染色体STR体系各种遗传组合PI 值计算方法：
见表1~3，表中p、q、r分别表示等位基因P、Q、R的分布频率。

4.1采样要求
    对于三联体，采集被检测男子、孩子生母与孩子的样本用于检验；对于二联体，采集被检测男子与孩子的样本用于检验；对于祖父母与孙的鉴定案例，则采集被检测祖父、祖母、孩子生母与孩子的样本用于检验。样本一般是血液（斑）或口腔拭子（唾液斑），其它人体生物学材料如带毛囊毛发、羊水、组织块、精液（斑）等亦可作为亲权鉴定的样本。样本必须分别包装，注明被采样人姓名、编号、采样人、采样日期等，置于冰箱冷藏或冻存。
    采样时，需要填写采样单，写明委托方名称、采样日期、采样类型、被采样人姓名、性别、称谓、出生日期、证件号码等，并拍摄被采样人照片，由被采样人在采样单上留下右手拇指或食指指纹（婴儿可留右脚拇趾印），并签名确认（婴幼儿的姓名由其监护人代签）。
    对于接受了外周血干细胞移植的当事人，应避免采集其血样作为检验材料，宜取其口腔拭子（唾液斑）或毛发进行检验。

4.2DNA 提取
   采用Chelex-100法（见如下步骤）或其它经过了验证的方法抽提DNA。若不经过DNA抽提而直接将检材用于PCR，方法必须经过验证。

4.2.1 从血样中提取DNA：
a)    在1.5mL 离心管中加1mL纯水，然后加入血样（不少于3µL血液或9mm2 血斑），小心混匀；放置30min，间歇振荡；
b)    10,000-15,000 r/min 离心2-3min；小心移去上清液。若样品为血斑，则保留载体；
c)    沉淀中加入5% Chelex 100（100-200目）200µL，56℃保温30min；
d)    高速振荡5-10s；沸水浴8min；
e)    高速振荡5-10s；10,000-15,000 r/min 离心2-3min，取上清液用于扩增反应；2-8℃保存或冻存剩余DNA。
     4.2.2 从口腔刮拭物样本中提取DNA：
a)    用牙签刮拭口腔粘膜，将其放入1.5mL 离心管内，加入200µL5%Chelex（100-200 目)；搅动，使细胞脱落；
b)    56℃保温15-30min；表1 三联体常染色体STR 基因座亲权指数计算公式

生母基因型	孩子基因型	生父基因（推断）	被检父基因型	PI 值计算公式
PP	PP	P	PP	1/p
PP	PQ	Q	QQ	1/q
PP	PP	P	PQ	1/(2p)
PP	PQ	Q	QR	1/(2q)
PP	PQ	Q	PQ	1/(2q)
PQ	QQ	Q	QQ	1/q
PQ	QR	R	RR	1/r
PQ	QR	R	RS	1/(2r)
PQ	PR	R	PR	1/(2r)
PQ PQ PQ PQ PQ	QQ PQ PQ PQ PQ	Q P 或Q P 或Q P 或Q P 或Q	QR PP QQ PQ PR	1/(2q) 1/(p+q) 1/(p+q) 1/(p+q) 1/[2(p+q)]

表 2 二联体常染色体 STR 基因座亲权指数计算公式

表3祖孙常染色体STR基因座亲权指数计算公式

4.5.2.3 Y-STR 检测系统的 PI 值计算
PI=1/f （f 指单倍型在群体中的频率）
4.5.2.4 X-STR 检测系统的 PI 值计算（见表 4、表 5）

4.6 检验过程中特殊情况的处理
a) 经 DNA 检测（系统的累计非父排除率在 99.99%以上），发现各基因座符合相应的遗传定律，
2000<CPI<10000，增加检测其它的具有高度多态性且遗传稳定的 DNA 遗传标记亦未发现不符合遗传规律的基因座，可据此支持亲权关系的存在。
b) 经常染色体 DNA 检测（系统的累计非父排除率在 99.99%以上），发现 1~2 个基因座不符合相应的遗传定律（考虑存在突变），这种情形下，应增加检测其它的高度多态性且遗传稳定的 STR 基因座；若被检验的孩子为女孩，应尽可能对被检父母与女孩增加检测 X-STR；若被检验的孩子为男孩，且被检父与孩子可能的生父不属同一父系，应尽可能对被检父与男孩增加 Y-STR 的检验。将突变基因座写入报告书中，并按突变基因座 PI 值的计算方法（见备注）计算 PI 和 CPI 值。计算后若发现 CPI≤0.0001，则据此排除亲权关系；若 0.0001＜CPI＜10000，则不排除亲权关系。
备注 1：若三联体中存在不符合遗传规律的常染色体遗传标记，如孩子的表型为 PQ，被检测男子表型为 P"R，其中 P"比 P 小或大 1 个或 2 个重复单位（s=1或 2），µ 为该基因座平均突变率，p 为等位基因 P 的频率，亲权指数计算方法为：
突变为1步(s=1), 则: PI =X/Y = µ/(4p) 突变为2步(s=2), 则: PI =X/Y = µ/(40p) 突变为3步(s=3), 则: PI =X/Y = µ/(400p) 余此类推（见表6）
表6 三联体中存在不符合遗传规律的遗传标记时亲权指数计算实例

(以 D7S820 为例，平均突变率 µ 为 0.002 )

基因座孩子生母孩子被检测父亲亲权指数

D7S820	7	7-8	9-11	µ/(4P8)
D7S820	7	7-8	10-11	µ/(40P8)
D7S820	7	7-8	11-12	µ/(400P8)
D7S820	7	7-8	9	µ/(2P8)
D7S820	7-8	8	9	µ/(2P8)
D7S820	7-8	8	7-9	2µ/(4P8)
D7S820	7-8	8	9-11	µ/(4P8)
D7S820	7-9	7-9	10-11	µ/[4(P7 + P9)]
D7S820	7-9	7-9	10	µ/[2(P7 + P9)]
D7S820	7-9	7-9	8-10	3µ/[4(P7 + P9)]
D7S820	7-8	7-9	7-8	µ(1+1/3.5)/(4P9)
D7S820	9	7-8	7	µ /(2×3.5×P8)

注：表中P7、P8、P9为相应等位基因7、8、9的频率备注2：若二联体中存在不符合遗传规律的常染色体遗传标记，如孩子的表型为PQ，被检测男子表型为P"R，其中P"比P 小或大1个或2个重复单位（s=1或2），µ为该基因座平均突变率，p为等位基因P 的频率，则亲权指数计算方法为：
突变为1步(s=1)，则: PI =X/Y = µ/(8p) 突变为2步(s=2)，则: PI =X/Y = µ/(80p) 突变为3步(s=3)，则: PI =X/Y = µ/(800p) 余此类推（见表7）表7 二联体中存在不符合遗传规律的遗传标记时亲权指数计算实例

c) 若被检父与可能的生父存在特殊的血缘关系（如父子关系、叔侄关系、同胞兄弟关系等），在可能的情况下，应同时提取孩子生母和其他的可疑父亲的样本进行检验。
d) 在祖孙关系鉴定中，经常染色体 DNA 检测（系统的累计非父排除率在 99.99%以上），若发现 1~2 个基因座不符合相应的遗传定律（考虑存在突变），应增加检测其它的高度多态性且遗传稳定的 STR 基因座；若被检验的孩子为女孩，应尽可能对被检祖母与孙女增加 X-STR 的检验；若被检验的孩子为男孩，应尽可能对被检祖父与孙子增加 Y-STR 的检验。若仍然只有原来的基因座不符合遗传规律，则将这些基因座当作突变基因座处理，写入报告书中，出具“不排除存在生物学祖孙关系” 的鉴定意见。

Time：2011年5月15日

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