当前已广泛应用的DNA 扩增方式主要有2种:聚合酶链式反应( polymerase cha in reaction, PCR)和滚环复制( ro lling c ircle amplificat ion, RCA )。滚环复制是以环状的DNA 为模板进行的复制方式, 其最早发现在原核生物的体内, 随后人们在体外也模拟出了这种复制方式 。RCA 相对于PCA 来说有其自身的优势和特点。首先, 它是一种恒温的扩增方式, 对于这种扩增方式其不需要昂贵的热循环仪器。其次,RCA 所应用的DNA 聚合酶ph i29 DNA聚合酶也有其自身的优势:DNA 链合成速度约为50 bp / s, 另外,phi29DNA 聚合酶的纠错能力强, 错误率 显著低于Taq DNA 聚合酶再次, RCA也有很高的扩增效率, 其线性扩增倍数为105, 指数化扩增能力大于109。该技术是一种痕量的分子检测方法, 可用于极微量的生物大分子和生物标志物的检测与研究。要获得小片段的DNA 主要应用的是化学合成的办法, 目前并没有太好的办法对小片段DNA 进行扩增, 只有Van N ess J等描述了一种恒温扩增单链寡核苷酸片段的方法。这种方法是利用一种热稳定的切刻内切酶N. B stNB I对寡核苷酸片段打上切口, 这样寡核苷酸就会从模板上脱落, 产生一个5突出的末端, 随后聚合酶就可以补齐这个末端产生新的寡核苷酸, 新合成的寡核苷酸片段又可以被切刻内切酶N.B stNB I打上切口, 聚合酶又可以进行复制, 这样就达到了扩增小片段DNA 的目的。应该说应用这种方法进行小片段DNA 的扩增有很大的局限性, 因为其扩增方式是等温扩增, 对扩增DNA 的长度有着严格的限定。DNA 太长, Tm值就会太高, 切刻内切酶对寡核苷酸片段打上切口后寡核苷酸片段就不会从模板上脱落; 相反DNA太短Tm 值就会太低, 寡核苷酸片段就很容易从模板上脱落。这种方法只能扩增8 ~ 16个碱基的寡核苷酸, 对于太长或太短的DNA 扩增就无能为力。传统的PCR 方法是最常用的DNA 扩增方法, 其可以扩增几kb 甚至是十几kb 的DNA 片段, 但是PCR 所用的引物就有20多bp, 因此对于过小的DNA片段的扩增无能为力。本研究以合成的小片段DNA为实验材料, 用单链DNA 连接酶( ssDNA ligase)的连接单链核酸的性质将30 bp的小片段DNA 自成环, 随后用滚环复制的方法将小片段DNA 扩增出来并进行酶切回收, 达到了扩增小片段DNA 的目的, 本方法解决了上述几种实验方法中无法扩增小片段DNA 的难题, 使片段扩增的效率、准确率都得到了提高, 而且使小片段扩增不再受到限制。

    传统的产前诊断如羊膜腔穿刺、绒毛膜取样、脐带穿刺等,对母体或胎儿均有一定的危险,可致胎儿畸形甚至死胎。自1997 年Lo等证实孕妇血浆(血清)中存在胎儿的DNA 后,非创伤性产前诊断广泛开展。主要应用于性别鉴定 、血型鉴定 、遗传性疾病诊断等。要进行产前诊断必须确认孕妇血浆样本中胎儿DNA是否提取成功,即确认胎儿DNA存在。由于孕妇血浆中同时存在着少量的胎儿DNA及大量母体DNA,因此为确认胎儿DNA存在,一般分析来自父方且与母体不同的那部分胎儿核苷酸序列。研究者目前一般检测Y染色体上的特异性基因如SRY基因、DYS14[ 2 ]等。但是该方法存在局限性,只能用于孕男性胎儿的孕妇产前检测。如果想要从孕妇血浆中获得更多的胎儿遗传信息包括女性胎儿的遗传信息,则需要扩增Y染色体以外的常染色体上的遗传标志。STR 是理想的DNA遗传标记,是以核心序列重复单位数目的变化构成遗传多态性,广泛存在于人类基因组中的一类具有高度多态性的遗传学标记。而STR 绝大多数位于非编码区,不转录、不编码蛋白质和RNA,不受选择压力的影响,其两条带的扩增产量相等,不存在优先扩增和漏带现象。因此STR 作为一种较为理想的遗传标记,已被用于染色体病、单基因病等多种遗传病的产前诊断研究[ 7 ] 。本研究中我们应用多重荧光PCR方法扩增了36名孕妇血浆和其丈夫外周血标本的短串联重复序列( short tandem repeat,STR)多态位点,探讨利用孕妇血浆中胎儿DNA进行无创伤性产前诊断的可行性。